Download Molekular- und Zellbiologie: Aktuelle Themen by B. M. Jockusch, A. Füchtbauer (auth.), Nikolaus Blin, PDF

By B. M. Jockusch, A. Füchtbauer (auth.), Nikolaus Blin, Michael F. Trendelenburg, Erwin R. Schmidt (eds.)

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Die Sequenzierung von DNA gehort zu den Standardmethoden in nahezu allen mo1eku1arbio10gischen Labors. Der vorliegende Artikel soll eine kurze theoretische EinfUhrung in die Problematik der zur VerfUgung stehenden Sequenzierungstechniken sein und fortgeschrittenen Studenten die Obersicht Uber die vielen Variationen dieser Techniken erleichtern. FUr die praktische AnwenduDg der beschriebenen Methoden wird auf die Origina11iteratur verwiesen. bzw. die LektUre von Hindleys "DNA sequencing" empfohlen.

Vom "zweifach-endmarkierten" zum "einfach-endmarkierten" MolekUl Doppelstrangige DNA-MolekUle, die mit einer Restriktionsendonuklease geschnitten wurden und identische Enden haben, werden normalerweise an ihren beiden Enden gleichstark radioaktiv markiert. Dies gilt prinzipiell fUr alle Endmarkierungstechniken. Lediglich wenn die beiden Enden eines MolekUls verschieden sind, Z. B. weil das DNAFragment aus einer Doppelrestriktion mit zwei verschiedenen Restriktionsendonukleasen stammt, kann man mit Hilfe der "filling in" Reaktion eine "Einfachendmarkierung" erreichen.

Zur Sequenzierung werden oetrennt zwei Restriktionen durchgefUhrt,die eine mit XbaI, die andere mit BamHI. Beide E~zyme hinterlassen 5'-Uberhangende Enden, so daB sie ein ideales Substrat fUr die problemlose und einfache 3'-Endmarkierung mit Hilfe der Polymerase I-AuffUllreaktion darstellen. Nach der 3'-Endmarkierung werden dann die BamHI-Probe mit EcoRI und die XbaI-Probe mit HindIII sekundar restringiert. Dadurch entstehen einfaeh endmarkierte DNA-Fragmente, die den zu sequenzierenden Bereich umfassen, und zwar in beiden Richtungen, so daB in einem Experiment die komplementaren Strange bestimmt werden konnen.

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